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    新聞資訊
    提取組織器官RNA|多樣品組織勻漿機來操作
    時間:2020-07-24 10:27? 點擊數:194次

      樣品組織RNA的提取實驗:這次實驗的樣品組織主要有小鼠的各個組織器官(如肝臟,肌肉,脂肪等)和人腫瘤標本(如結直腸癌,肺癌,乳腺癌)

      多樣品組織勻漿機的研磨效果圖

      1.首先要根據需要抽提的組織樣品的質量加入相應的TRIZOL液體,同時加入若干顆不銹鋼柱。本實驗室一般情況如下:(小鼠組織加入TRIZOL,結直腸癌標本加入TRIZOL)  

      注意:

      a.需事先預冷試管座  

      b.用凈信勻漿機進行勻漿處理時樣品體積最好不要超過TRIzol體積10℅)  

      2.把加入樣品,TRIZOL,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預冷好的試管座中。機器設置好參數蓋上蓋子,點擊運行  

      3.機器運行完畢后,打開蓋子,拿出凈信EP管仔細觀察組織的研磨情況,如果沒有明顯的塊狀物,那就可以進入下一步實驗步驟,如果沒有完全打碎,還需要把EP管放入試管座中,繼續勻漿。有些堅硬,或者脂肪含量高的組織(乳腺)可能需要稍微長一點的時間,時間可以依據組織實際的研磨情況來調整勻漿時間。 

      4.和傳統的TRIZOL提取RNA的方法一樣,將勻漿樣品在室溫放置幾分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。  

      5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩若干秒,室溫放置幾分鐘。  

      6.2-8℃10000×g離心十幾分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。  

      7.把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入異丙醇,室溫放置幾分鐘。  

      8.2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。  

      9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心幾分鐘,棄上清。

      10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心干燥,過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入無RNase的水,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。


    常見問題分析:  

      1、DNA污染: 

      A.樣品勻漿時加的試劑量太少  

      B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液 

      2、得率低: 

      A.樣品裂解或勻漿處理不徹底  

      B.RNA沉淀未完全溶解  

      C.檢測吸光度時,RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高  

      D.樣品勻漿時加的試劑量太少  

      E.勻漿樣品時未在室溫放置幾分鐘  

      F.吸取水相時混入了有機相  

      3、RNA降解  

      A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍  

      B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃  

      C.細胞在用胰酶處理時過度  

      D.溶液或離心管未經RNase去除處理  

      E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5


    預防RNase污染注意事項:  

      1.配制溶液應使用無RNase的水  

      2.經常更換新手套,皮膚上常帶有的細菌,霉菌可能成為RNase的來源。  

      3.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。  

      4.RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染,但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。


      本實驗已經研磨的各個組織中發現肝臟組織是最容易研磨,研磨效率是最好的。 

      下圖A是RNA經過傳統的液氮研磨和勻漿器研磨法抽出的RNA跑膠圖,結果很明顯發現這種方法是可行的,是可以代替傳統的方法的。

      液氮研磨和勻漿器研磨效果

      下圖B是利用組織勻漿器對小鼠的各個組織進行勻漿抽出的RNA跑膠圖。發現在抽提各個組織的RNA的時候也是可行的。

      組織勻漿器研磨效果

      圖C是利用組織勻漿器對人結腸癌標本進行了研磨后抽提出的RNA的跑膠圖。

      組織勻漿器研磨效果

      圖D是小鼠的肝臟組織經過手工研磨和機器勻漿后,最后抽提得到的RNA進行了濃度的測定,結果說明組織勻漿器抽提出得RNA的濃度要顯著高于傳統的手工的方法得到的RNA。

      手工研磨和機器勻漿效果

    蛋白質的提?。?/strong>  

      A.根據需要抽提的組織樣品的質量加入相應的蛋白質裂解液(如RIPA),同時加入3顆不銹鋼柱。(小鼠肝臟組織加入1mlRIPA蛋白裂解液,人結直腸癌組織加入500ulRIPA蛋白裂解液) 

      B.把加入樣品,蛋白裂解液,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預冷好的試管座中。機器設置好參數蓋上蓋子,點擊運行。  

      以下同上RNA的操作方法  

      最終所得到的蛋白質濃度的測定經過BCA試劑盒測定完成的,同時通過SDS-PAGE后經過考馬斯亮藍染色和western blot檢測都發現其要比傳統的方法更加簡便快捷,不容易引起交叉污染。 

      更多實驗細節可致電工作人員!

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